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    技術服務

    慢病毒技術服務

    作者:admin 來源:本站 發布時間: 2017-09-26 21:46  瀏覽次數:
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     慢病毒概述

    慢病毒( Lentivirus)屬于逆轉錄病毒科(Retroviridae),為RNA病毒,如人免疫缺陷病毒(HIV)、貓免疫缺陷病毒(FIV)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、牛免疫缺陷病毒等。由于對HIV-1的研究最廣泛最深入,對其生物學特性最為了解,因此HIV-1來源的慢病毒載體已成為其中的代表。


     

    圖1 HIV-1 RNA結構圖

    HIV-1為雙鏈RNA病毒,共有9個基因,如圖1所示。gag、pol、env3個基因編碼病毒的基本結構,tat、rev為調節基因,vif、vpr、vpu、nef 4個為輔助基因。其中,gag基因編碼病毒的核心蛋白,包括基質蛋白、衣殼蛋白、核衣殼蛋白;pol基因編碼病毒復制所需的酶,如反轉錄酶、整合酶、蛋白酶,env基因編碼病毒的包膜糖蛋白,決定病毒感染宿主的靶向性。rev編碼的蛋白調節gag、pol、env的表達水平,tat編碼的蛋白參與RNA轉錄的控制。4個輔助基因編碼的蛋白則作為毒力因子參與宿主細胞的識別和感染。兩端為長末端重復序列(LTR),內含復制所需的順式作用元件,如包裝信號元件Ψ。

    第一代慢病毒載體系統是以三質粒系統為代表,該系統由包裝質粒、包膜質粒及載體質粒3種質粒組成。包裝質粒是HIV-1前病毒基因組5’端LTR由巨細胞病毒早期啟動子取代,3’LTR由SV40 polyA序列取代。包裝成分分別構建在兩個質粒上,一個表達gag和pol,另一個表達env。載體質粒攜帶了5’端LTR,和全部5’端非翻譯區域,另外還帶有rev應答元(RRE)。包膜表達質粒使用水皰性口炎病毒糖蛋白G基因(VSV-G)用來代替了原病毒的env基因。

    第二代慢病毒載體系統是在第一代的基礎上進行改進,在包裝質粒中刪除了HIV的所有輔助基因(vif、vpr、vpu和nef基因)。這些附屬基因的去除并不影響病毒的滴度和感染能力,同時增加了載體的安全性。

    第三代慢病毒載體系統由四質粒代替原有的三質粒包裝系統。將rev基因單獨放在一個包裝質粒上。同時又增加了兩個安全特性:一是構建自身失活的慢病毒載體,即刪除了U3區的3′LTR,使載體失去HIV-1增強子及啟動子序列,即使存在所有的病毒蛋白也不能轉錄出RNA;二是去除了tat基因,用異源啟動子序列代替,這樣原始的HIV-1基因組中的9個慢病毒載體中只保留了3個(gag、pol和rev)。因此第三代慢病毒載體系統更加安全。

    慢病毒優點

    1、宿主范圍廣包裝病毒時用VSV-G基因代替了原病毒的env基因,宿主范圍更廣,如神經元細胞、肝細胞、心肌細胞、腫瘤細胞、內皮細胞、干細胞等多種類型的細胞。 

    2、感染能力強慢病毒載體對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力,能感染絕大多數細胞,對一些難于轉染的細胞,比如神經元細胞、干細胞或其它原代細胞有較好的感染效率。    

    3、具有整合能力  慢病毒載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上,從而達到持久性表達,因此可用于構建穩定表達目的蛋白/RNAi的細胞株,也可以用于制備轉基因動物。

    整體實驗流程

    慢病毒包裝技術路線:

    包裝過程:

    (1)轉染前一天,將細胞接種到100mm dish中,控制細胞轉染時的密度為70-80%。

    (2)轉染前一小時取出細胞培養板,去除原有細胞培養基,加入10ml的Opti-MEM培養基,將細胞放回培養箱。

    (3)制備轉染試劑和質粒的復合物: 

    將待轉染的病毒載體質粒32μg(骨架質粒:穿梭質粒=1:1)溶于Opti-MEM培養基,總體積為500μl,輕輕混勻,靜置5min。 

    將Lipofectmin2000轉染試劑溶于Opti-MEM培養基,總體積為500μl,輕輕混勻,靜置5min。 

    將Lipofectmin2000轉染試劑稀釋液滴加到質粒稀釋液中,邊加邊輕輕混勻后在室溫放置20min,使DNALipofectmin2000轉染試劑充分結合形成穩定的轉染復合體。

    取出細胞培養板,將上面配好的DNA- Lipofectmin2000轉染試劑復合體加入到細胞培養板中,做好標記,放回培養箱。
    6h后吸去培養基,PBS洗一次,加入10ml新鮮完全培養基培養。

    收毒:

    (1)轉染48h后,第一次收毒,收集培養基至50ml離心管中,做上標記,并給細胞更換新鮮的完全培養基。

    (2)轉染72h后,第二次收毒,收集培養基至50ml離心管中,做上標記,丟棄細胞。

    注:廢棄的含病毒的培養基加入84消毒液(1:20左右),浸泡一天后丟棄。接觸過病毒的槍頭,離心管,培養板等其他物品可用84消毒液稀釋液處理,也可以用煮沸處理半小時或高壓濕熱滅菌(121℃,30min)處理。

    3.慢病毒純化:

    (1)普通離心機:3500rpm,10min,RT離心后,上清馬上倒入新的50ml離心管,0.45μm,過濾上清到超速離心管中。上清分裝到12支超速離心管,兩兩對應配平衡,不夠的體積可用不含血清的培養基配平。

    (2)超速離心機:HITACHI,30,000rpm,2h,4℃,離心后,可觀察到管壁一側有白色的病毒沉淀,做上記號。在安全柜中,打開離心管,小心地棄上清,離心管倒扣在滅菌過的吸水紙上,棄未去除干凈的上清。每管根據沉淀量添加DPBS,80μl-120μl/管,用封口膜封住管口,4℃溶解沉淀過夜。

    (3)將同一種病毒,逐管收集法收集病毒到最后一管,再用100μl DPBS收集2次,全部收到1.5ml 離心管中,按要求分裝病毒,標記(病毒名稱,年-月-日)-80℃冰箱保存。

    (4.)慢病毒滴度檢測(Real time 定量PCR 法測定滴度):

    (1)樣品制備:

    (a)消化293T細胞,按1×105細胞每孔接種24孔板。

    (b)細胞貼壁后(鋪板后4~6h)加入病毒。

    (c)12~20h后換液,去掉含病毒的培養基。

    (d)感染后72h拍照記錄熒光,收集細胞抽取基因組DNA并做定量PCR實驗測定滴度。

    (2)Real-time PCR 檢測:

    Real-time PCR 在ABI7500 上完成。SYBR Master Mixture 來自TAKARA。

    (a)下列比例配置反應體系:

     

    (b) 設定程序為兩步法Real-Time 定量。預變性95℃,15s,之后每一步變性95℃,5s,退火延伸60℃,34s,共進行40 個循環。每次在延伸階段讀取吸光值。
    Cycle 1: (1X)
    Step 1: 95.0 ℃ for 00:15.
    Cycle 2: (40X)
    Step 1: 95.0 ℃ for 00:05.
    Step 2: 60.0 ℃ for 00:34.
    Data collection and real-time analysis enabled.

    (c) 制作熔解曲線。PCR 結束后, 在95℃變性1min。然后冷卻至55℃,使DNA 雙鏈充分結合。從55℃開始到95℃,每一步增加0.5℃,保持30s, 同時讀取吸光值。
    Cycle 3: (1X)
    Step 1: 95.0 ℃ for 01:00.
    Cycle 4: (1X)
    Step 1: 55.0 ℃ for 01:00.
    Cycle 5: (81X)
    Step 1: 55.0 ℃-95.0 ℃ for 00:30.
    Increase set point temperature after cycle 2 by 0.5 ℃           

                                      
    服務流程:

     

    客戶提供

    簽訂合同支付預付款

    安提海拉生物服務

    交付結果交付尾款

    客戶得到

    目的基因序列信息

     

    腺病毒載體構建

     

    與合同對應的病毒量以及對照病毒

    病毒載體要求

     

    病毒包裝純化

     

    詳細的實驗報告

    其它要求

     

    滴度測定等

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    北京畢特博生物提供的慢病毒:

    我們采用第三代4質粒慢病毒包裝系統,生物安全性更高; 

    采用VSV-G包膜,宿主范圍更廣; 

    產生的慢病毒滴度高,可達108~1010TU/mL; 

    各種慢病毒穿梭載體可供選擇:過表達、ShRNA、miRNA、Tet誘導表達載體等; 

    可帶有熒光報告基因(GFP、RFP、mCherry、Luciferase等)和藥篩標記基因(Puromycin、Neomycin、Hygromycin等),有多種啟動子(CMV、PGK、CAG、Ubc等)可供選擇; 

    3~4周內即可完成病毒包裝服務。

    運輸和儲存 

    對于長距離運輸,應先將慢病毒載體保存在-80℃,再采用全程干冰運輸,以防滴度下降。 

    慢病毒載體在-80℃保存6個月,滴度不會明顯下降。建議保存6~12個月以上的樣品,進行實驗前,重新測一次滴度。應盡量避免反復凍融(小于3次)。 

    使用前從-80℃取出病毒,立即放在37℃水浴鍋中,輕輕晃動,使其盡快溶解,操作過程應置于冰盒上進行。用不完的

    毒可以暫時放在4℃冰箱中,但最好盡快用完。

     

    北京畢特博生物技術有限責任公司

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