2×SYBR Green PCR Master Mix 是采用 SYBR Green I 嵌合熒光法進行 Real Time PCR 的專用試劑。含有常溫下完全封閉 Taq 酶活性的熱啟動酶 HS Taq DNA Polymerase,能夠有效抑制低溫條件下引物非特異性退火或者引物二聚體引起的非特異性擴增，提高擴增反應的特異性。本試劑經過特殊配制，采用優化配方的qPCR 專用 Buffer，大大提高了 qPCR 反應的擴增效率和檢測靈敏度，可以在較寬的定量區域內得到良好的標準曲線，準確進行定量。本試劑與多數廠家的熒光定量 PCR 儀兼容，如 Applied Biosystems、Eppendorf、Bio-Rad 和Roche 等。

產品組成	A4004S	A4004M
2×SYBR Green PCR Master Mix	1 mL	5×1 mL
ROX Reference Dye I（50×）	40 μl	200 μl
ROX Reference Dye II（50×）	40 μl	200 μl

儲存條件：

本產品-20℃保存有效期至少一年，4℃可保存3個月。解凍后應充分混勻，避免產生大量氣泡。

試劑原理：

   本產品利用熱啟動酶 HS Taq DNA polymerase 進行 qPCR 擴增反應，通過擴增產物嵌合SYBR Green I 而激發的熒光信號強度進行檢測。
1、 PCR
   PCR 法是以微量 DNA 進行目的片段擴增的方法。通過 DNA 鏈的熱變性、引物退火、DNA 聚合酶作用下引物的延伸三個步驟循環往復，可在短時間內擴增大量 DNA 片段。
2、熒光檢出
   SYBR Green I 是一種結合與小溝中的雙鏈DNA 結合染料，與雙鏈 DNA 結合后，其熒光大大增強，最大吸收波長約為 497nm，發射波長最大約為 520nm。
   SYBR Green I 可以與所有的雙鏈 DNA 相結合，無需使用探針，即可實現檢測，通用性好，且靈敏度很高。但是，由于 SYBR Green I 與所有的雙鏈 DNA 相結合，因此由引物二聚體、單鏈二級結構以及錯誤的擴增產物引起的假陽性會影響定量的精確性。在定量儀器檢測過程中，可以通過測量升高溫度后熒光的變化，由解鏈曲線來分析產物的均一性，從而區分產物的熔解峰溫度而區分特異與非特異的產物。

使用方法：

反應條件
1、兩步法
熱啟動：95℃ 10 分鐘；
變性：95℃ 10～20 秒；
退火/延伸：60℃ 20～60 秒。   35--45個循環
熔解曲線分析。

2、三步法
熱啟動：95℃ 10 分鐘；
變性：95℃ 10～20 秒；
退火：56-64℃ 10～30 秒；
延伸：72℃ 10～60 秒。     35--45個循環
熔解曲線分析。
對于 Roche LightCycler480，熱啟動時間應采用 10min，ABI7500 也可以采用 5min 熱啟動。

qPCR反應體系配制：

建議的模板量 10～100ng（基因組 DNA）或 1～10ng（cDNA 模板）。

試劑	20μl 體系	50μl 體系	終濃度
2×SYBR Green PCR Master Mix	10μl	25μl	1×
Primer 1（10μM）	0.4～2μl	1～5μl	0.2～1.0μM
Primer 2（10μM）	0.4～2μl	1～5μl	0.2～1.0μM
Template DNA	4μl	10μl	-
ROX Reference Dye（optional）	0.4μl	1μl	1×
ddH2O	Variable	Varible	-
Total volume	20μl	50μl	-

適用機型：

以下機型無需使用ROX Reference Dye校正：

Ø Roche LightCycler 480，Roche Light Cycler 96，MJ Research Chromo4，MJ Research Opticon 2，Takara TP-800，Bio-Rad iCycler iQ,Bio-Rad iCycler iQ5,Bio-Rad CFX96,Bio-Rad C1000 Thermal Cycler,Thermo Scientific Pikoreal 96,Qiagen Corbett Rotor-Gene 6000，Qiagen Corbett Rotor-Gene G,Qiagen Corbett Rotor-